轉基因植物研究農桿菌轉化法（Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation）：
根癌農桿菌感受態(tài)細胞（EHA101，EHA105，LBA4404，GV3101，AGL1）
發(fā)根農桿菌感受態(tài)細胞（MSU440，C58C1，K599，Ar A4，Ar.Qual，Ar 1193）
搜索關鍵詞：
根癌農桿菌（A. tumefaciens）；發(fā)根農桿菌（A. rhizogenes）；GV3101；MSU440；Rifampicin (Rif) 利福平；乙酰丁香酮；1/2 MS Medium; 農桿菌介導轉化；
基本概念：
農桿菌（Agrobacterium）是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，常見的有兩種：根癌農桿菌（A. tumefaciens）和發(fā)根農桿菌（A. rhizogenes）。根癌農桿菌能在自然條件下趨化性的感染大多數雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，誘導產生冠癭瘤。誘發(fā)冠癭瘤的原因在于根癌農桿菌Ti質粒上的T-DNA含8個左右的基因能在植物細胞內表達，指導合成一種非常特殊的化合物冠癭堿，進而引發(fā)轉化細胞癌變；而發(fā)根農桿菌能誘導產生發(fā)狀根，特征在于大量增生高度分支的根系。根癌農桿菌Ti質粒（150～200kb）和發(fā)根農桿菌Ri質粒（200～800kb）上的一段T-DNA，當農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，Ti質?；騌i質粒上的T-DNA區(qū)脫離質粒而整合到植物基因組。
正因如此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系，能通過將目的基因插入到經過改造的T-DNA區(qū)，借助農桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移和整合，并通過細胞和組織培養(yǎng)技術，得到轉基因植物。這就是農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation）。目前，此方法不僅在實驗室中普通用于雙子葉植物的感染，還成功用在非農桿菌寄主生物，比如真菌，單子葉植物，裸子植物甚至動物細胞等的轉化。目前得到普遍應用，特別是植物的轉基因工程研究。
操作流程（農桿菌轉化法）：
農桿菌介導的轉化（Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation）涉及多個步驟：1）從起始物種中分離感興趣基因；2）建立功能性的轉基因構建子包括感興趣基因、驅動表達的啟動子、密碼子修飾（若是需要以提高成功的蛋白表達）、篩選基因（便于篩查出成功轉入目的基因的宿主植物）；3）將轉基因插入到Ti質粒上；4）將含T-DNA的質粒轉化進入農桿菌；5）將轉化后的農桿菌與植物細胞混合，從而允許T-DNA整合進入植物染色體；6）遺傳工程成功改造的植物體再生；7）在實驗室、溫室和大田水平來測試轉基因表達效果。見圖1，根癌農桿菌介導的植物轉化示意圖。
植物轉化用T-DNA雙元載體（質粒）：
雙元載體系統(tǒng)（Binary-vector system）是植物基因工程常用的載體系統(tǒng)。
雙元載體系統(tǒng)包含兩個不同的質粒：一種是野生宿主源的小復制子（wide-host-range small replicon），含有一復制起始點（ori），能夠讓質粒在包括大腸桿菌和農桿菌在內的細菌內維持生長，這類質粒通常含有a）替換T-DNA的外源DNA；b）T-DNA左右邊界序列（或至少含T-DNA右邊界）；c）同時維持和篩選大腸桿菌和農桿菌的標志基因；d）植物生長的篩選標志基因；一種是輔助型Ti質粒（helper Ti plasmid），缺乏完整的T-DNA區(qū)域，但是含有完整的vir區(qū)，能夠激活T-DNA的轉移。
表1、常用的農桿菌T-DNA雙元載體
載體系列 | 載體ori/inc | 重要特征a | 細菌篩選基因b | 植物篩選基因c |
pBIN | IncPα | mcs with blue/white selection | Kan | Kan |
pGA | IncPα | cos site ColE1 ori | Kan | Kan |
SEV | IncPα | Reconstitutes a missing T-DNA border; not a binary vector | Kan | Kan/Nos |
pEND4K | IncPα | cos site, mcs with blue/white selection | Kan/Tet | Kan |
pBI | IncPα | PromoterlessgusAgene for promoter studies | Kan | Kan |
pCIB10 | IncPα | Chimeric antibiotic-resistance gene | Kan | Chimeric Kan/Hyg |
pMRK63 | pRi | pRi-based vector (borders from pRi) | Amp/Kan | Kan |
pGPTV | IncPα | PromoterlessgusAgene for promoter studies | Kan | Kan/Hyg/Bar/Bleo/Dhfr |
pCGN1547 | pRi + ColE1 | ColE1 ori for high copy no. inE. colimcs with blue/white selection | Gent | Kan |
pART | IncPα+ ColE1 | ColE1 ori for high copy no. inE. colipromoter/polyA expression cassette | Spec | Kan |
pGKB5 | pRiA4 | PromoterlessgusAgene for promoter studies | Kan | Kan/Bar |
pMJD80 pMJD81 | IncPα | Ω, untranslated leader | Kan | Kan |
pPZP | pVS1 | Small, stable, mcs with blue/white selection | Spec/Chl | Kan/Gent |
pBINPLUS | IncPα | Selectable marker near LB ColE1 ori | Kan | Kan |
pRT100 pRT-Ω/Not/Asc | IncPα | Rare-cutting sites (NotI,AscI) | Kan | Kan/Hyg/Bar/Dhfr |
BIBAC | pRi | T-DNA binary vector designed to transfer large DNA fragments | Kan | Hyg |
pCB series | IncPα | Mini binary vectors small backbone, not self-mobilizable | Kan | Bar |
pGreen | IncW | ColE1 ori mcs with blue/white selection | Kan | Kan/Hyg/Sul/Bar |
pPZP-RCS2 | pVS1 | Multiple rare-cutting sites for cassette insertion. Uses pPZP200 as backbone | Spec | Kan/Gent |
GATEWAY destination vector | pVS1 | ColE1 ori. Uses pPZP200 as backbone | Spec | Kan/Hyg/Bar |
pMDC | pVS1 | Based on pCAMBIA (except pMDC7, from PER8). Facilitates protein tagging | Kan; Spec for pMDC7 | Kan/Hyg/Bar |
pRCS2 | pVS1 | Contains rare-cutting sites | Spec | Kan/Hyg/Bar |
pRCS2-ocs | pVS1 | Cloning of multiple genes | Spec | Kan/Hyg/Bar |
pEarleyGate | pVS1 | Based on pCAMBIA. Facilitates protein tagging | Kan | Bar |
pGWTAC pMDC99 | pRiA4 | Multi-Round Gateway for cloning multiple genes | Kan | Hyg |
pORE | IncPα | Based on pCB301 ColE1 ori FRT sites. PromoterlessgusAorgfpgene for promoter studies | Kan | Kan/Pat |
pSITE | pVS1 | Fluorescence protein fusion. Based on pRCS2 | Spec | Kan |
pMSP | IncPα | Super-promoter to drive expression of goi | Kan | Kan/Hyg/Bar |
pCAMBIA | pVS1 | Multiple vectors for cloning, expression, and tagging | Kan/Chl | Kan/Hyg/Bar |
pGD | PVS1 | Derived from pCAMBIA1301. Multiple vectors for tagging proteins with DsRed2 or GFP | Kan | Hyg |
acos, Bacteriophageλcohesive ends; mcs, multiple cloning site; ori, vegetative origin of replication; Ω, tobacco mosaic virus translational enhancer. bAmp, Ampicillin; Bar, resistance to phosphinothricin; Bleo, bleomycin; Chl, chloramphenicol; Dhfr, dihydrofolate reductase; Gent, gentamicin; Hyg, hygromycin; Kan, kanamycin, Nos, nopaline synthase; Pat, resistance to phosphinothricin; Spec, spectinomycin; Sul, sulfonylurea; Tet, tetracycline. Reference：Lee LY et al. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 2008 Feb;146(2):325-32. | ||||
植物轉化用農桿菌菌株類型：
植物雙元載體轉化用的農桿菌菌株有很多，如何選擇合適的農桿菌，不僅要考慮到轉化的農作物以及農作物自身品系，還要考慮到搭配所用的雙元載體以及轉化方法等。具體實驗還是需多參閱文獻和實驗室自身工作經驗，來選擇適當的農桿菌菌株。以下列出幾款常用的農桿菌菌株應用范疇。
表2、常用根癌農桿菌感受態(tài)細胞的應用范疇
農桿菌種類 | 轉化方法 | 對應貨號 | 應用范疇 |
EHA101 | 化轉/電轉 | MF2301/MF2306 | 適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作 |
EHA105 | 化轉/電轉 | MF2302/MF2307 | 適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作 |
LBA4404 | 化轉/電轉 | MF2303/MF2308 | 適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作 |
GV3101 | 化轉/電轉 | MF2304/MF2309 | 適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物轉基因操作 |
AGL1 | 化轉/電轉 | MF2305/MF2310 | 適用于水稻、擬南芥、楊樹等植物的轉基因操作 |
表3、常用發(fā)根農桿菌感受態(tài)細胞的應用范疇
農桿菌種類 | 轉化方法 | 對應貨號 | 應用范疇 |
MSU440 | 化轉/電轉 | MF2451/MF2452 | 適用于玉米、煙草、茶樹、青蒿等植物的轉基因操作 |
C58C1 | 化轉/電轉 | MF2453/MF2454 | 適合廣泛的宿主范疇（薔薇科，夾竹桃科，豆科，茄科，黃芩，煙草等植物） |
K599 | 化轉/電轉 | MF2455/MF2456 | 含pRi2659農桿堿型Ri質粒，適合廣泛的宿主范疇（葫蘆科，豆科，茄科等植物） |
Ar A4 | 化轉/電轉 | MF2457/MF2458 | 適用于煙草、玉米、胡蘿卜、甘草等植物轉基因操作 |
Ar Qual | 化轉/電轉 | MF2459/MF2460 | 適用于玉米、煙草、番茄、桿菌等植物的轉基因操作 |
Ar 1193 | 化轉/電轉 | MF2461/MF2462 | 含pRi1193農桿堿型Ri質粒，特別適合豆科，茄科植物的轉基因操作 |